1922' de Allison ile beraber "lizozim" enziminin (gözyaşı) tutuklayıcı ve durdurucu özelliğini keşfetti. 1927' den sonra "penicillium" cinsinden bir küfün özelliklerini inceledi. Bu küfün, streptokok bakterilerini tutuklayıcı ve durdurucu kabiliyeti olan "penisilin" denilen bir madde çıkardığını gördü.
Fleming, 1929' da penicillium küfünün bakteriyolojik incelemesini bitirmişti, fakat araştırmalarını devam ettirecek ve penisilini kimyasal yolla elde edecek kaynaklara sahip değildi. Çalışmalarına 1939' da sir Howard Florey ve Ernest Boris Chain ilgi gösterdi. Bu iki bilgin, 1940' da penisilini deriştirerek toz haline getirmeyi başardılar.
Farmakolojik ve klinik araştırma, Oxford okulu tarafından yapıldı. Florey, penisilinin Amerika'da ilâç sanayiinde üretilmesini sağladı.
1942' de Royal Society üyeliğine seçilen, 1944' de "sir" ünvanını alan Fleming, 1945' de Chain ve Florey ile birlikte Nobel Tıp Ödülünü kazandı. Aynı yıl, "Penisilin ve pratik uygulaması" adlı eserini yayınlayan Fleming, 1955' de Londra'da öldü.
